发酵法生产番茄红素的菌种筛选与工艺开发

番茄红素作为一种高附加值的天然类胡萝卜素，传统提取依赖番茄等植物原料，存在受季节限制、提取率低、成本高等问题。微生物发酵法以其可控性强、产量稳定、绿色环保的优势，成为番茄红素工业化生产的重要发展方向。该技术的核心在于高产菌种的筛选与改造，以及发酵工艺的优化与放大，二者协同实现番茄红素的高效合成与积累。

一、番茄红素生产菌种的筛选策略与优势菌株

番茄红素的生物合成途径广泛存在于细菌、真菌和微藻中，菌种筛选的核心目标是获得天然产率高、生长速率快、遗传稳定性好、易于工业化培养的菌株，同时兼顾产物提取的便捷性。

1. 菌种筛选的主要来源与方法

（1）自然环境筛选

从土壤、植物根际、果实表面等富含类胡萝卜素的生境中分离菌株，通过选择性培养基富集+显色初筛+HPLC定量复筛的三步法筛选高产菌株。

选择性富集：采用添加β-紫罗酮（类胡萝卜素合成抑制剂）或氨苄青霉素的培养基，抑制非目标菌株生长，富集产类胡萝卜素的微生物；

显色初筛：类胡萝卜素具有特征性红色，将菌株接种于平板培养基，培养后观察菌落颜色，挑选红色至深红色的菌落，初步判断番茄红素合成能力；

定量复筛：将初筛菌株进行摇瓶发酵，采用有机溶剂提取发酵产物，通过高效液相色谱（HPLC）测定番茄红素含量，筛选出产率高于10 mg/L的优势菌株。

（2）基因工程改造筛选

针对天然菌株产率低的缺陷，通过基因编辑技术对目标菌株的番茄红素合成途径进行定向改造，是提升产量的关键手段。改造策略包括：

强化关键合成基因：过表达番茄红素合成途径中的限速酶基因，如八氢番茄红素合成酶基因（crtB）、八氢番茄红素脱氢酶基因（crtI），打破代谢瓶颈；

阻断支路代谢途径：敲除将番茄红素转化为β-胡萝卜素、叶黄素等衍生物的基因（如crtY），使代谢流集中流向番茄红素；

优化调控因子：导入全局调控基因（如ispDF）增强前体物质（异戊烯焦磷酸，IPP）的供应，提升番茄红素的合成前体池容量。

2. 工业应用潜力的优势菌株

（1）细菌类菌株

噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）：天然具备完整的番茄红素合成途径，是基因工程改造的模式菌株。通过敲除*crtY*基因阻断β-胡萝卜素合成，同时过表达*crtB*和*crtI*，摇瓶发酵产率可达50~80mg/L，具有生长速率快、发酵周期短（24~36h）的优势，但需优化培养基以降低胞外多糖对产物提取的影响。

成团泛菌（Pantoea agglomerans）：耐渗透压能力强，可在高糖培养基中生长，通过代谢工程改造后，番茄红素产率可达100mg/L以上，且菌体易于破壁提取，适合工业化放大。

（2）真菌类菌株

红酵母（Rhodotorula spp.）：如黏红酵母（*Rhodotorula glutinis*），天然产番茄红素、β-胡萝卜素等类胡萝卜素，细胞壁较薄，产物提取难度低。通过优化碳氮源比例，摇瓶发酵产率可达20~40mg/L，且可利用工业废液（如糖蜜、玉米浆）为原料，降低生产成本，适合食品级番茄红素的生产。

三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）：传统用于β-胡萝卜素生产，通过敲除番茄红素环化酶基因，可将代谢流转向番茄红素。该菌株发酵过程中菌丝体易于形成颗粒，传质效率高，补料发酵产率可达300mg/L以上，是目前发酵法生产番茄红素的高产菌株之一，但存在发酵周期长（5~7d）、需严格控制溶氧的缺点。

（3）微藻类菌株

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）：以产虾青素闻名，通过调控培养条件（如高光照、低氮胁迫）可诱导其合成番茄红素。该菌株产物为胞内积累，且番茄红素纯度高，但生长速率慢，产率较低（5~15mg/L），适合高端医药级产品的小规模生产。

二、发酵工艺的开发与优化

发酵工艺开发的核心是协调菌株生长与产物合成的关系，通过优化培养基配方、发酵参数和培养模式，实现番茄红素产量的最大化。工艺开发分为摇瓶优化和工业化放大两个阶段。

1. 培养基配方优化

培养基是菌株生长和产物合成的物质基础，需重点优化碳源、氮源、无机盐及前体物质的配比。

（1）碳源选择与优化

碳源不仅为菌株生长提供能量，也是番茄红素合成的前体来源。

优选碳源：葡萄糖、蔗糖是细菌和真菌的高效碳源，红酵母和三孢布拉氏霉可利用糖蜜、淀粉水解液等低成本碳源，降低工业生产成本；

浓度调控：碳源浓度过高易导致菌体过度生长，产生碳分解代谢物阻遏（CCR），抑制类胡萝卜素合成酶活性；浓度过低则无法满足产物合成需求，例如，噬夏孢欧文氏菌的适宜葡萄糖浓度为20~30g/L，三孢布拉氏霉的适宜蔗糖浓度为40~50g/L。

（2）氮源选择与优化

氮源影响菌株的生长速率和代谢途径的调控，需选择“速效氮源+缓效氮源”的复合氮源。

速效氮源：如酵母膏、蛋白胨，促进菌株快速生长，缩短延滞期；

缓效氮源：如玉米浆、豆饼粉，缓慢释放氮元素，维持稳定的产物合成速率；

碳氮比（C/N）：是调控生长与产物合成的关键参数。高C/N比（20:1~30:1）有利于番茄红素积累，低C/N比则促进菌体生长，例如，红酵母发酵的适宜C/N比为25:1，此时番茄红素产率比低C/N比条件提升40%以上。

（3）无机盐与前体物质添加

无机盐：添加Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺等金属离子，可激活类胡萝卜素合成酶的活性；磷酸盐浓度需严格控制，高浓度磷酸盐会抑制产物合成；

前体物质：添加异戊烯醇、甲羟戊酸等番茄红素合成前体，可直接提升产物产量；添加维生素B族（如核黄素），可增强菌株的抗氧化能力，减少番茄红素的降解。

2. 发酵参数优化

发酵参数直接影响菌株的代谢环境，需重点调控温度、pH、溶氧、搅拌转速等关键因子。

（1）温度与pH调控

温度：采用“分段控温”策略，发酵前期（0~12h）控制温度为30~32℃，促进菌体快速生长；发酵后期（12h后）降至25~28℃，降低菌体呼吸速率，转向产物合成，例如，三孢布拉氏霉发酵后期降温至26℃，番茄红素产率可提升30%；

pH：细菌发酵的适宜pH为7.0~7.5，真菌发酵的适宜pH为5.5~6.5。发酵过程中可通过添加氨水、盐酸或缓冲液维持pH稳定，避免pH波动导致酶活性下降。

（2）溶氧与搅拌转速调控

番茄红素合成属于好氧代谢过程，溶氧不足会导致代谢流转向无氧呼吸，抑制产物合成。

搅拌转速：摇瓶发酵的转速控制在180~220r/min，保证培养基溶氧充足；发酵罐放大时，通过调节搅拌转速（200~500r/min）和通气量（1~2vvm），维持溶氧浓度在30%~50%饱和溶氧值；

溶氧分段调控：发酵前期高溶氧促进生长，后期适度降低溶氧（20%~30%），可减少能量消耗，促进番茄红素积累。

3. 培养模式优化

相较于分批发酵，补料分批发酵和连续发酵更适合工业化生产，可显著提升番茄红素产量。

（1）补料分批发酵

这是目前应用广泛的培养模式，通过在发酵后期连续补加碳源、前体物质，维持培养基中底物浓度稳定，避免底物限制和产物抑制。

补料策略：采用恒速补料或反馈补料（根据溶氧、pH变化调整补料速率），例如，对三孢布拉氏霉进行葡萄糖补料发酵，番茄红素产率可达500mg/L以上，远高于分批发酵的300 mg/L；

补料时机：在菌体生长进入稳定期时开始补料，此时菌体生长速率下降，代谢流转向产物合成。

（2）连续发酵

适合大规模工业化生产，通过连续流加新鲜培养基并排出等量发酵液，维持菌体的稳定生长和产物合成状态。连续发酵可显著缩短发酵周期，提高设备利用率，但对菌株的遗传稳定性和工艺控制精度要求较高，目前仅在少数高产菌株（如成团泛菌）中实现应用。

三、发酵产物的提取与纯化

发酵法生产的番茄红素主要积累在菌体内，高效的提取纯化工艺是保障产品品质的关键。

1. 菌体预处理

通过机械破壁（高压均质、超声破碎）或化学破壁（添加溶菌酶、表面活性剂）的方法，破坏菌体细胞壁，释放胞内番茄红素，例如，采用高压均质机（压力60~80MPa）处理红酵母菌体，破壁率可达90%以上。

2. 提取与纯化

溶剂提取：采用正己烷、丙酮等有机溶剂进行萃取，萃取液经减压浓缩得到番茄红素粗品；

层析纯化：通过硅胶柱层析、高效液相色谱层析等方法，去除粗品中的β-胡萝卜素、叶黄素等杂质，获得纯度高于95%的番茄红素精品；

结晶干燥：将纯化后的番茄红素溶液进行重结晶，真空干燥后得到番茄红素晶体粉末。

四、工业化应用的挑战与发展趋势

1. 核心挑战

高产菌株的遗传稳定性：基因工程改造菌株在传代过程中易出现质粒丢失、基因表达下调等问题，导致产率下降，需通过染色体整合技术提升遗传稳定性；

发酵成本控制：目前发酵法番茄红素的生产成本仍高于植物提取法，需开发利用工业废液（如酿酒废液、味精废液）的培养基配方，降低原料成本；

下游提取效率：菌体破壁和溶剂萃取过程的能耗较高，需开发绿色提取技术（如超临界CO₂萃取），提升提取效率并减少有机溶剂残留。

2. 未来发展趋势

合成生物学改造：利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，构建“底盘细胞+合成途径”的人工菌株，实现番茄红素的高效合成；

固液发酵耦合：开发固态发酵工艺，利用农业废弃物（如秸秆、麸皮）为基质，降低生产成本，同时简化提取工艺；

多产物协同生产：构建番茄红素与虾青素、β-胡萝卜素等类胡萝卜素的共合成菌株，实现“一菌多产”，提升发酵过程的经济效益。

发酵法生产番茄红素的核心在于高产菌种的筛选与改造和发酵工艺的精准优化。自然筛选可获得安全稳定的菌株，基因工程改造则能突破天然菌株的产率瓶颈；补料分批发酵是目前适合工业化放大的培养模式，通过分段调控温度、溶氧等参数，可实现番茄红素产量的最大化。未来，随着合成生物学和绿色提取技术的发展，发酵法将逐步取代传统植物提取法，成为番茄红素工业化生产的主流技术。

本文来源于：西安大丰收生物科技有限公司 http://www.dafengshou88.com/