番茄红素生物合成途径的代谢工程

番茄红素是一种天然的红色类胡萝卜素，具有强抗氧化活性，广泛应用于食品、医药、保健品等领域。其生物合成途径主要存在于植物（如番茄、西瓜）和微生物（如大肠杆菌、酵母）中，天然提取受原料限制且成本较高，代谢工程技术通过改造宿主菌株的代谢网络，定向强化番茄红素合成通量、阻断竞争支路、优化前体供给，实现番茄红素的高效异源合成，是当前工业化生产的核心技术方向。

一、番茄红素生物合成的核心途径

番茄红素的生物合成属于类胡萝卜素合成通路的分支，以通用前体异戊烯焦磷酸（IPP） 和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP） 为起点，分为三大模块，不同宿主的通路核心酶存在差异，但反应逻辑高度保守。

1. 前体供应模块（IPP/DMAPP合成）

生物体内存在两条IPP合成途径：一是存在于植物叶绿体和微生物细胞质中的甲羟戊酸途径（MVA途径），以乙酰辅酶A为原料，经甲羟戊酸等中间产物生成IPP；二是存在于植物质体和细菌中的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径（MEP途径），以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸为原料合成IPP。IPP与DMAPP在异戊烯基转移酶作用下，逐步缩合生成牻牛儿基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP），最终生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP），GGPP是所有类胡萝卜素合成的直接前体。

2. 核心骨架合成模块（从GGPP到番茄红素）

该模块是番茄红素合成的关键步骤，由两步反应完成：首先，2分子GGPP在八氢番茄红素合成酶（CrtB） 催化下缩合生成八氢番茄红素；随后，八氢番茄红素在八氢番茄红素脱氢酶（CrtI） 催化下，经4步脱氢反应依次生成ζ-胡萝卜素、链孢红素、番茄红素，该过程是番茄红素合成的限速步骤之一。

3. 竞争支路模块

生物体内的GGPP和番茄红素易流入竞争支路，导致合成通量流失：GGPP可被香叶基香叶基还原酶、萜类合成酶等催化，生成叶绿素、甾醇、萜类等副产物；番茄红素则可被番茄红素环化酶（CrtY） 催化生成β-胡萝卜素，进一步合成叶黄素、玉米黄质等其他类胡萝卜素，这些竞争支路是代谢工程改造的重点阻断对象。

二、番茄红素代谢工程改造的核心策略

代谢工程改造的核心逻辑是“开源、截流、调流”，即强化前体供给、阻断竞争支路、优化关键酶活性，同时结合宿主生理特性适配代谢网络，提升番茄红素的合成效率。

1. 开源：强化前体IPP/DMAPP与GGPP的供给

前体不足是制约番茄红素高产的首要瓶颈，通过过表达前体途径关键酶、优化途径调控机制，提升前体物质的合成通量。

途径选择与关键酶过表达

不同宿主的优势前体途径不同：大肠杆菌等原核生物天然存在MEP途径，通过过表达MEP途径的关键酶（如1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR），可显著提升IPP的合成量；酵母等真核生物天然存在MVA途径，过表达MVA途径的限速酶（如乙酰辅酶A乙酰转移酶AtoB、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1），能大幅提高细胞质中IPP的浓度。

此外，过表达GGPP合成酶（CrtE） 是连接前体与类胡萝卜素通路的关键，CrtE可催化FPP与IPP缩合生成GGPP，过表达高活性的CrtE变体（如来源于噬夏孢欧文氏菌的CrtE），能有效打通前体到类胡萝卜素合成的瓶颈，减少中间产物的积累。

途径调控与动态优化

前体途径的关键酶常受代谢物反馈抑制，例如MVA途径的HMG-CoA还原酶受胆固醇反馈抑制，通过对酶基因进行定点突变，解除反馈抑制，可显著提升酶活性。同时，采用动态调控启动子（如基于群体感应的启动子、代谢物响应启动子），替代组成型启动子，实现前体途径的按需表达，避免因过量表达关键酶导致宿主生长负担过重。

2. 截流：阻断竞争支路，减少通量流失

阻断竞争支路可将代谢流定向引导至番茄红素合成通路，核心是敲除竞争支路的关键酶基因，或抑制其表达。

阻断GGPP的竞争支路

敲除宿主中催化GGPP流向副产物的关键酶基因：在大肠杆菌中，敲除编码香叶基香叶基还原酶的ispH基因旁侧调控序列，抑制叶绿素合成；在酵母中，敲除甾醇合成途径的关键酶基因ERG9（法尼基焦磷酸合成酶），减少甾醇的生成，但需通过外源添加甾醇或优化启动子强度，避免影响宿主生长。

阻断番茄红素的环化支路

番茄红素环化酶CrtY是竞争支路的核心靶点，在天然产类胡萝卜素的菌株（如噬夏孢欧文氏菌）中，敲除crtY基因，可完全阻断番茄红素向β-胡萝卜素的转化；在异源表达宿主（如大肠杆菌、酵母）中，避免引入crtY基因，同时优化载体构建策略，确保仅表达番茄红素合成的核心酶基因（crtB、crtI、crtE）。

3. 调流：优化核心合成酶的活性与表达模式

核心合成酶（CrtB、CrtI）的活性和表达水平直接决定番茄红素的合成速率，通过酶分子改造、表达元件优化，提升酶的催化效率和稳定性。

关键酶的分子改造

采用定向进化、定点突变等技术改造CrtB和CrtI：例如，对CrtB进行定点突变，增强其与GGPP的结合亲和力；对CrtI进行突变，提高其脱氢反应的催化效率，或增强其在宿主细胞内的可溶性表达。此外，将CrtB与CrtI进行融合表达，构建融合酶，可减少中间产物的扩散损失，提高催化效率。

表达元件的优化

选择适配宿主的强启动子、核糖体结合位点（RBS），调控核心酶的表达水平和比例：例如，在大肠杆菌中选用T7启动子驱动crtE、crtB、crtI的表达，通过优化RBS序列的强度，使三个基因的表达量达到适宜的比例，避免因某一酶过量表达导致中间产物积累，或因表达不足形成代谢瓶颈。

4. 宿主适配性改造：降低代谢负担，提升细胞耐受性

异源合成番茄红素会给宿主细胞带来代谢负担，同时番茄红素的积累可能对细胞产生毒性，通过宿主改造提升其耐受性和适配性。

细胞膜通透性改造

番茄红素是疏水性物质，易在细胞内积累形成包涵体，通过敲除大肠杆菌的细胞膜相关基因（如ompF、tolC），或过表达编码外排泵的基因，增强细胞膜对番茄红素的通透性，促进番茄红素向胞外分泌，减少胞内毒性。

抗氧化系统强化

番茄红素合成过程中会产生活性氧（ROS），损伤细胞，通过过表达宿主的抗氧化酶基因（如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT），增强细胞的抗氧化能力，提升菌株的生长速率和番茄红素产量。

生长与合成的平衡调控

采用双阶段培养策略：第一阶段优化培养条件（如温度、pH、碳源），促进宿主细胞快速生长，积累生物量；第二阶段诱导番茄红素合成途径的表达，定向强化合成通量，避免合成途径与细胞生长争夺资源。

三、典型宿主的代谢工程改造案例

1. 大肠杆菌宿主

大肠杆菌是番茄红素异源合成的常用原核宿主，通过整合MEP途径强化、竞争支路阻断、核心酶优化等策略，已实现高产，例如，过表达MEP途径的dxs、dxr基因，敲除甾醇合成基因erg9的同源序列，优化crtE、crtB、crtI的表达比例，可使大肠杆菌的番茄红素产量达到数克每升的水平。

2. 酵母宿主

酵母（如酿酒酵母）的MVA途径通量高，且具有真核生物的蛋白折叠系统，适合表达复杂酶。通过过表达MVA途径的tHMG1、atoB等基因，敲除竞争支路基因，同时将核心酶基因定位于线粒体或内质网，利用细胞器的分隔效应提升合成效率，酵母的番茄红素产量已突破10g/L，具备工业化应用潜力。

3. 植物宿主

在番茄等天然产番茄红素的植物中，通过抑制番茄红素环化酶的表达，阻断向β-胡萝卜素的转化，同时过表达CrtB和CrtI，可大幅提升果实中的番茄红素含量，例如，采用RNA干扰技术抑制番茄中crtY基因的表达，果实番茄红素含量可提升2–3倍。

四、代谢工程改造的挑战与优化方向

当前番茄红素代谢工程仍面临诸多挑战：一是宿主的代谢网络复杂，过量强化某一途径易导致代谢失衡，影响细胞生长；二是关键酶的异源表达存在可溶性低、催化效率不足等问题；三是番茄红素的胞外分泌效率低，后续提取成本高。

优化方向主要集中在三方面：一是结合合成生物学工具（如CRISPR-Cas9基因编辑、代谢流组学分析），精准调控代谢网络，实现途径的动态优化；二是利用酶理性设计，定向改造核心酶的结构，提升其在宿主中的活性和稳定性；三是开发高效分泌系统，通过改造细胞膜转运蛋白，实现番茄红素的主动外排，降低提取成本，推动工业化生产的规模化应用。

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