天然柠檬酸在自然界中分布很广，天然的柠檬酸存在于植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中。人工合成的柠檬酸是用砂糖、糖蜜、淀粉、葡萄等含糖物质发酵而制得的。

很多种水果和蔬菜，尤其是柑橘属的水果中都含有较多的柠檬酸，特别是柠檬和青柠——它们含有大量柠檬酸，在干燥之后，含量可达8%（在果汁中的含量大约为47g/L）。在柑橘属水果中，柠檬酸的含量介于橙和葡萄的0.005mol/L和柠檬和青柠的0.30mol/L之间。这个含量随着不同的栽培种和植物的生长情况而有所变化。